B16

Línea celular B16 El melanoma B16 es una línea celular tumoral murina utilizada para los estudios de cáncer de piel, así como para la biología molecular y celular experimental. Es un modelo apto para el estudio del melanoma, y fue una de las primeras herramientas murinas efectivas para la investigación de la metástasis.

toc Figura 1. Células de melanoma B16 X10

=** Nombre de la línea. Tejido y organismo de origen. **=

El nombre de esta línea celular es B16. Surgió por primera vez de forma espontánea en la piel de la base de la oreja de un ratón (//Mus musculus//) híbrido C57B1/6J. Se origina generalmente en epitelios productores de melanina en ratones, y tras su transplante son fáciles de estudiar //in vivo//.

=** Breve recuerdo histórico **=

El melanoma B16 fue descubierto y conservado en los Jackson Laboratories, en Maine (EE. UU.) durante 1954, cuando el tumor se desarrolló espontáneamente en la oreja de un ratón C57BL / 6. Las células fueron extirpadas, trasplantadas y mantenidas //in vivo//, y a día de hoy se siguen conservando.  Esta línea celular se incorporó a la American Type Culture Collection en junio de 1978. Asimismo, en la edición de 1983 del Catálogo de tumores animales y humanos trasplantables, publicado por la División de Tratamiento del Cáncer, National Cancer Institute (NCI), se incluyó una carta donde se aprueba la distribución de las líneas de melanoma B16 depositadas por la propia institución.  Esta línea celular se ha usado en muchas investigaciones. Las cepas de células pigmentadas se establecieron //in vitro// a partir de este tumor, a principios de los años sesenta. Más tarde, se desarrolló un sistema de trasplantes animales y cultivo tisular para seleccionar las líneas tumorales B16 que poseyesen propiedades potenciadoras de la metástasis. La línea celular original fue nombrada con el número 26 y las líneas celulares hijas se designaron con 27, 28, 29 y 30. Después, Fidler las renombró como B16 linea F1 y consecutivas.

=** Caracterización de la línea **=

Morfológicamente se diferencian células tumorales altamente adherentes y poliédricas en forma de huso, dispuestas en mantos perivasculares y masas difusas (Fig. 1). Algunas células contienen finos gránulos pigmentados, sin embargo, otras se encuentran oscurecidas por grandes y muy oscuros glóbulos con pigmentación. Se ha observado que estas células, en las fases iniciales del cultivo poseen un tamaño reducido, con poca síntesis de melanina, pero un alto grado de actividad replicativa. Por otro lado, a medida que pasa el tiempo, pierden dicha actividad, no obstante, aumentan su tamaño y capacidad de síntesis del pigmento.  Según el Departamento de Salud y Servicios Sociales de los Estados Unidos, para trabajar con esta línea celular se requiere un nivel de bioseguridad 1, pues se trata de células que suponen un riesgo a nivel individual y poblacional bajo o nulo.  En cuanto a la genética de esta línea celular, en 1970 se describió que las células que la conforman presentan un total de 41 cromosomas (Fig. 2), mientras que el resto de células somáticas de ratón tiene un total de 40. Este cromosoma extra surgiría durante la replicación del material genético. Asimismo, las células del melanoma tienen 2 cromosomas metacéntricos que se diferencian fácilmente del resto debido a su gran tamaño, siendo característico de estas células. Poseen también un tercer cromosoma de elevadas dimensiones, pero al contrario que los otros dos, este es telocéntrico. A pesar de todo esto, el estado de los cromosomas en el momento de origen del tumor no se registró y, por lo tanto, ha sido imposible rastrear la secuencia de los cambios implicados. Además, probablemente este cariotipo descrito en 1970 represente solo uno de varios patrones en células B16 de otros cultivos.

=** Requerimientos para su mantenimiento **=

Según las referencias más antiguas encontradas, esta línea celular crece a una temperatura óptima de 37ºC en Medio Mínimo Esencial (MEM), o en medio suplementado con 10% de suero bovino fetal (FCS). Hoy en día, estudios más recientes utilizan el medio recomendado por la propia American Type Culture Collection (ATCC) , Medio de Cultivo Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de FCS, 1% aminoácidos no esenciales y 1% de penicilina-estreptomicina en una atmósfera humidificada que contiene un 5 % CO2 a 37ºC.  <span style="font-family: Arial,sans-serif; font-size: 10pt;">La ATCC <span style="font-family: Arial,sans-serif; font-size: 10pt;"> además indica que para la criopreservación del cultivo se debe utilizar dicho medio (95%) suplementado con dimetil sulfóxido (5%), y tiene que ser almacenado en fase de vapor de nitrógeno líquido. Otros datos aportados por la ATCC están relacionados con la realización de subcultivos, para lo que se recomienda: <span style="font-family: Arial,sans-serif; font-size: 10pt;">La propia organización aconseja cambiar el medio cada 2 o 3 días.
 * 1) <span style="font-family: Arial,sans-serif;">Eliminar el medio de cultivo original.
 * 2) <span style="font-family: Arial,sans-serif;">Lavar las células con una solución de EDTA-Tripsina con el fin de eliminar restos del suero que puedan inhibir el efecto de la tripsina.
 * 3) <span style="font-family: Arial,sans-serif;">Añadir de 2 a 3 mL de la misma solución y observar al microscopio invertido hasta comprobar que las células se han despegado del sustrato.
 * 4) <span style="font-family: Arial,sans-serif;">Añadir entre 6 y 8 mL de medio de cultivo y recoger las células con una pipeta.
 * 5) <span style="font-family: Arial,sans-serif;">Añadir las alícuotas necesarias a nuevos recipientes de cultivo.
 * 6) <span style="font-family: Arial,sans-serif;">Incubar los nuevos cultivos a 37ºC.

<span style="font-family: Arial,sans-serif; font-size: 10pt;"> ** Principales usos en investigación o clínica **

<span style="font-family: Arial,sans-serif; font-size: 10pt;"> La aplicación principal de esta línea celular es la de modelo de estudio de tumores, primordialmente de melanomas. Para ello, se ha estudiado la evolución de las características de estas células con el paso del tiempo. Estudios //in vitro// relacionan la pérdida de capacidad replicativa y de formación de colonias que sufre el melanoma B16 con los cambios que experimentan determinados tumores malignos //in vivo// a medida que van evolucionando. <span style="font-family: Arial,sans-serif; font-size: 10pt;"> En la investigación sobre el desarrollo de tumores, se han realizados ensayos con esta línea de células para comprobar los efectos de determinadas sustancias sobre la proliferación celular. Por ejemplo la teofilina, una xantina que es usada como estimulante del sistema nervioso central (SNC) y broncodilatador, y que además es un inhibidor de una fosfodiesterasa, encargada de regular los niveles de adenosín monofosfato cíclico (AMPc) en la célula. Cultivando B16 con teofilina, se comprobó que la células expuestas a este compuesto presentan una actividad proliferativa mucho menor que en ausencia de la xantina, además de una alta cantidad de melanina. De esta forma, se evidenció lo que estudios anteriores venían exponiendo, que el AMPc está implicado en el proceso proliferación celular. <span style="font-family: Arial,sans-serif; font-size: 10pt;"> Otro compuesto del que se ha evaluado su influencia sobre la línea B16, con el fin de conocer más sobre los procesos de melanogénesis y proliferación, es el ácido clorogénico (CGA), sustancia presente en numerosos alimentos, como la manzana, el café, e incluso utilizado en productos estéticos. Exponiendo las células tumorales al CGA se observó una significativa reducción de la proliferación celular, sin embargo, los niveles de melanina se vieron incrementados considerablemente, aunque después de aproximadamente unas 48 h, la cantidad de este pigmento disminuía, a causa de que un efecto a largo plazo del ácido clorogénico era la inhibición de tirosinasas, enzimas responsables de canalizar la síntesis de melanina. <span style="font-family: Arial,sans-serif; font-size: 10pt;"> <span style="font-family: Arial,sans-serif; font-size: 10pt;">Hoy en día, el melanoma B16 sigue siendo indispensable para los estudios de metástasis. E<span style="font-family: Arial,sans-serif; font-size: 13.3333px;">s usado para crear el modelo de ratón de xenoinjerto ( <span style="font-family: Arial,sans-serif; font-size: 13.33329963684082px;">trasplante de tejido de una especie a otra <span style="font-family: Arial,sans-serif; font-size: 10pt;"> ) B16 CDX (Cell Line Derived Xenograft), un CDX comúnmente usado para el estudio de la metástasis y la formación de tumores sólidos, así como para el cribado de terapias antiproliferativas. Este método se ha establecido como un estudio de referencia en la investigación preclínica del cáncer. <span style="font-family: Arial,sans-serif; font-size: 10pt;"> Los proyectos de investigación actuales se centran en la respuesta inmunológica de las células a las vacunas, las propiedades metastáticas mediadas por microARN, especialmente miR-21, un conocido factor de supresión de tumores y factores antiproliferativos.

= Descubrimientos científicos =

<span style="font-family: Arial,sans-serif; font-size: 10pt;"> Uno de sus primeros descubrimientos importantes con B16 fue en 1970. El Dr. Fidler tiñó B16s, cultivándolas in vitro, con 125I-5-yodo-2'-desoxiuridina para rastrearlas, e implantó las células en ratones C57BL / 6J. Sacrificó a los ratones en diferentes momentos y midió las células en la sangre y en diferentes órganos. Comprobando que el 99% de la población celular original había fallecido en un día y que una cohorte de aproximadamente 400 células había colonizado el pulmón. El estudio resultó de gran importancia porque estableció la existencia de una vía de metástasis confiable que no tenía complicaciones y permitía ver los diferentes cambios. También mostró que la metástasis no está garantizada simplemente por la presencia de células tumorales. Solo unas pocas pueden circular y engancharse al órgano correcto y comenzar a formar un tumor. <span style="font-family: Arial,sans-serif; font-size: 10pt;"> <span style="font-family: Arial,sans-serif; font-size: 10pt;">En la década de 1980 se descubrió que las células B16 expresan niveles muy bajos de glicoproteínas complejas de histocompatibilidad de clase I de ratón, H-2Kb y H-2Db <span style="font-family: Arial,sans-serif; font-size: 10pt;">, y que el tratamiento //in vitro// con interferón gamma indujo simultáneamente una alta expresión de H-2 y un aumento en el potencial metastásico de las células B16. <span style="font-family: Arial,sans-serif; font-size: 10pt;"> <span style="font-family: Arial,sans-serif; font-size: 10pt;">Se demostró en el año 1995 que, la edad era un factor negativo para el crecimiento del melanoma provocado por la variante maligna B16/Col/R. Demostrando que la respuesta inmune en ratones ancianos era mas eficaz contra este tipo de tumor frente a los ratones jóvenes. <span style="font-family: Arial,sans-serif; font-size: 10pt;"> <span style="font-family: Arial,sans-serif; font-size: 10pt;">Por otro lado, en 1996 se demostró mediante el empleo de esta línea celular una forma de regulación homeostática de lípidos en mamíferos. Para ello, se hidrolizaron los <span style="font-family: Arial,sans-serif; font-size: 13.333333015441895px;">glicoesfingolípidos ( <span style="font-family: Arial,sans-serif; font-size: 10pt;">GSL) del glicocálix de las células mediante la acción de endoglicoceramidasa (EGCase), enzima que rompe el enlace entre la ceramida y el azúcar que forman el compuesto. Como resultado, se observó que la síntesis de estos esfingolípidos aumentaba transitoriamente, restaurándose rápidamente hasta la normalidad el contenido en lípidos de la superficie celular. Aun así, se apreció que el contenido en ceramida total de la célula seguía siendo el mismo que antes del tratamiento con la EGCase, pues el aumento de ceramida libre en la superficie de la célula genera una retroalimentación negativa que impide la síntesis de la propia molécula, impidiendo que los niveles de este lípidos se encuentre a niveles más altos de lo normal.

=Vídeos de interés=

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 * <span style="font-family: Arial,sans-serif; font-size: 13.333333015441895px;">División de células tumorales del melanoma B16

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 * Melanoma B16 sobre matriz de fibronectina

media type="youtube" key="Q4MyWPKQsfQ" height="360" width="640" align="center"
 * Movimiento de célula tumoral del melanoma B16

<span style="font-family: Arial,sans-serif; font-size: 10pt;"> **Referencias**

<span style="font-family: Arial,sans-serif; font-size: 10pt;">