C6


 * ÍNDICE **
 * 1) Historia, organismo y tejido de origen
 * 2) Caracterización de la línea
 * 3) Requerimientos para el mantenimiento
 * 4) Características especiales
 * 5) Principales usos en investigación
 * 6) Descubrimientos importantes
 * 7) Almacenamiento y criopreservación
 * 8) Bibliografía

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Figura 1. Neuroesferas formadas a partir de células de glioma de rata C6. Cultivo en medio DMEM F12 suplementado y libre de suero a 10X. ( http://cybertesis.uach.cl/tesis/uach/2014/fcd339p/doc/fcd339p.pdf)

1-Historia, organismo y tejido de origen.
La línea celular C6 se trata de una línea celular procedente de Glioma (celulas gliales tumorales) de rata, Rattus norvegicus. La línea C6, procedente de tejido cerebral y fue clonada gracias a la inducción mediante la inyección del carcinógeno N-nitrosomethylurea, después de una serie de cultivos alternados y pasaje por animales (ATCC, 1992.; Benda, 1968; Gysin, 1980; Pfeiffer, 1970)

Esta linea fue hallada por Philippe Benda y su depósito se realizó en el año 1986.

2-Caracterización de la línea
La forma de estas células depende, en gran parte, de las condiciones de cultivo utilizadas. Las células que crecen en cultivos en suspensión son casi siempre redondas con pocas prolongaciones. Sin embargo, cuando crecen sobre superficies planas muestran una diversidad morfológica notable, con prolongaciones celulares y neuritas, que se forman con facilidad, mientras que los cuerpos celulares adoptan una forma alargada (ATCC, 1992.; Benda et al., 1968).

<span style="font-family: Arial,Helvetica,sans-serif;">El origen glíal de la C6, fue confirmado por la producción de altos niveles de la proteína S-100, el fenotipo molecular más característico del cerebro de los vertebrados y que ha sido encontrado en numerosos tumores cerebrales, tanto de humanos como en otros animales (ATCC, 1992.; Benda, 1968; Gysin, 1980; Pfeiffer, 1970). Se ha sugerido que la S-100 puede tener un papel importante en el desarrollo y fisiología del cerebro (Phillips, 1993), quizás en el control de la actividad de la trombina localizada en el cerebro con propósitos, tales como mitogénesis y diferenciación (Dinhanich,1991) o en la modulación de la acción de la endotelina-1 sobre las arterias cerebrales (Ehrenreich, 1993).Entre las propiedades específicas del glioma C6, están la biosíntesis de proteína S-100 (Gysin, 1980; Phillips, 1993) y la inducción de la glicerol 3-fosfato deshidrogenasa mediante la hidrocortisona (Rindler, 1978). Lo mismo ocurre con la inducción de la lactato deshidrogenasa mediante la noradrenalina, que es precedida por una elevación del AMP cíclico.La movilización de glucógeno glíal mediante la noradrenalina también está presente en estas células y está mediada por AMP cíclico. Estos efectos resultan de la interacción de la noradrenalina con los receptores b situados en la superficie delas células glíales, ya que los b-antagonistas impiden estas respuestas (McMorris, 1973). Se ha demostrado en líneas de glioma C6-2B que la acumulación de AMP cíclico es inhibida por incremento de la concentración de Ca+2 en el citosol(Debernardi, 1993).

<span style="font-family: Arial,Helvetica,sans-serif;">3-Requerimientos para su mantenimiento
<span style="font-family: Arial,Helvetica,sans-serif;">Para cultivar células C6 de glioblastoma de rata se deben seguir los siguientes pasos:

<span style="font-family: Arial,Helvetica,sans-serif;">A)En primer lugar, las células C6 de glioma de rata deben haber crecido en monocapa sobre placas con medio DMEM suplementado. Este medio tiene debe tener la siguiente composición: > <span style="color: #545454; font-family: arial,sans-serif; font-size: small;">µg/ml)
 * <span style="font-family: Arial,Helvetica,sans-serif;">Medio Advanced DMEM
 * <span style="font-family: Arial,Helvetica,sans-serif;">Suero bovino fetal (10%)
 * <span style="font-family: Arial,Helvetica,sans-serif;">L-Glutamina (2mM)
 * <span style="font-family: Arial,Helvetica,sans-serif;">Mezcla de antibióticos: Penicilina G+estreptomicina+gentamicina (50000U/L, 50mg/L, 50
 * <span style="font-family: Arial,Helvetica,sans-serif;">Antimicótico: Anfotericina B (5mg/l)
 * <span style="font-family: Arial,Helvetica,sans-serif;">Mezcla aminoácidos no esenciales (1%)

<span style="font-family: Arial,Helvetica,sans-serif;">B)Procedimiento de siembra primaria:
 * 1) Descongelamiento del vial con las células en baño de agua a 37°C.
 * 2) Transferir el contenido del vial a un tubo de 15mL y mezclar con 10mL de medio DMEM suplementado.
 * 3) Tomar 5mL de la suspensión de células y depositarlos en una caja Petri para cultivo, de 150mm.
 * 4) Incubar a 37°C con una atmósfera al 5% de CO2
 * 5) Realizar la observación diaria de la línea celular y verificar su adherencia a la placa.
 * 6) Una vez adheridas realizar el cambio de medio cada aproximadamente cada 48h según la confluencia de las células (cuando las células está aproximadamente a un 85% de confluencia).

<span style="font-family: Arial,Helvetica,sans-serif;">C)El siguiente paso es realizar el cambio de medio:
 * 1) Retirar todo el medio viejo de cada placa Petri de cultivo con una pipeta y desecharlo.
 * 2) Añadir 10mL de medio DMEM suplementado nuevo a cada placa.
 * 3) Incubar a 37°C y 5% de CO2 hasta confluencia mayor o igual al 80%.

<span style="font-family: Arial,Helvetica,sans-serif;">D)Después del cambio de medio, el siguiente paso es resembrar (Confluencia mayor o igual al 80%):
 * 1) Retirar por completo el medio viejo de cada placa Petri y desecharlo.
 * 2) Añadir 3mL de solución de tripsina/EDTA a cada placa Petri, homogeneizar suavemente por agitación e incubar a 37°C por 5 min.
 * 3) Asegurar la resuspensión de todas las células rociando el interior de la caja Petri con la misma solución de tripsina de la placa varias veces.
 * 4) Tomar la solución de tripsina con las células de cada placa y transferirla a un tubo de 15mL.
 * 5) Añadir la misma cantidad de medio DMEM suplementado que la cantidad de tripsina recolectada en el tubo de 15mL, para realizar la neutralización de la tripsina.
 * 6) Homogeneizar perfectamente subiendo y bajando el líquido con una pipeta, al menos 15 veces.
 * 7) Centrifugar a 2000xg por 5 minutos.
 * 8) Desechar el sobrenadante sin resuspender el botón celular.
 * 9) Resuspender el botón celular con entre 1mL y 10mL de medio DMEM suplementado y transferir 0.5mL a un nuevo tubo de 15mL, dependiendo de la cantidad de células que se deseen resembrar.
 * 10) Añadir 10mL de medio DMEM suplementado al nuevo tubo de 15mL con las células y homogeneizar con pipeta.
 * 11) Añadir 5mL de la solución de células a cada placa Petri para cultivo. 12-Incubar a 37°C y 5% de CO2.

A continuación se muestra un seguimiento fotográfico del crecimiento de la línea celular: Figura 2. Crecimiento de la línea celular C6 (http://cybertesis.uach.cl/tesis/uach/2014/fcd339p/doc/fcd339p.pdf)

Podemos observar en A (2 días de cultivo) aún células adheridas a la placa, con clara diferenciación celular; en B (4 días de cultivo) se observa la pérdida de la forma fibroblástica, característica de las células de glioma diferenciadas, obteniéndose células circularizadas; en C(6 días de cultivo) se comienzan a obtener los cúmulos de células, observándose los primeros cluster de incipientes neuroesferas y en D (9 días de cultivo) se observan neuroesferas ya definidas, las cuales, en este tipo celular, son aglomeraciones de células circulares en suspensión con una forma no tan circular pero si definida para C6. Sabemos entonces, que ya en el día 9 existe presencia de neuroesferas.


 * 4-Características especiales**

La línea celular C6, se caracteriza por ser un modelo celular glial (https://dialnet.unirioja.es/servlet/tesis?codigo=71405). La línea celular C6 es un modelo celular ampliamente utilizado en el estudio de propiedades gliales in vitro, además ya existen antecedentes previos en esta línea celular en stem cells, así como también nos permite entregar antecedentes preliminares para una siguiente investigación (http://cybertesis.uach.cl/tesis/uach/2014/fcd339p/doc/fcd339p.pdf). Existen multitud de estudios que realizan comparaciones en los comportamientos entre las lineas celulares C6 y U87 (procedente de glioblastoma humano). Cabe destacar que la mayoría de estudios están enfocados a investigación de la cura del cáncer.

<span style="font-family: Arial,Helvetica,sans-serif;">5-Principales usos en investigación
<span style="font-family: Arial,Helvetica,sans-serif;">El glioblastoma es el tipo de tumor cerebral primario más común y agresivo en los humanos. Aunque puede tratarse con extirpación quirúrgica, radioterapia y quimioterapia, el pronóstico y el resultado siguen siendo insatisfactorios (Zhuang et al. 2011).

<span style="font-family: Arial,Helvetica,sans-serif;">Las células de la línea C6 células producen proteína S-100 que se encuentra en el tejido nervioso de los vertebrados y se ha encontrado en tumores cerebrales. Al inyectar células C6 en ratas recién nacidas, podría inducirse un tumor que concuerde con GBM patológicamente (Auer et al., 1981). La implantación de células malignas en el tejido cerebral animal se parece mucho al crecimiento tumoral in vivo y tiene la ventaja sobre los modelos simplificados de que los mecanismos inflamatorios y vasculares se activan.

<span style="font-family: Arial,Helvetica,sans-serif;">En modelos de cultivo celular, se puede investigar el efecto de los factores de crecimiento, los componentes de la matriz extracelular, las proteasas y las moléculas de adhesión. La secreción de factores derivados de tumores en el medio también se puede analizar cuando se usan modelos simplificados [1]

<span style="font-family: Arial,Helvetica,sans-serif;">Por lo tanto, la línea celular de glioma C6 puede servir como un vivo experimental de células de glioblastos multiformes (GBM), que a su vez es útil para investigar el mecanismo de crecimiento tumoral, angiogénesis, invasión y diseño de terapias anticancerígenas (San-Galli et al., 1989 Bernstein et al., 1990, 1991, Nagano et al., 1993, Abramovitch et al, 1995, Chicoine y Silbergeld, 1995). Las células de glioma C6 también se han aplicado para estudiar la diferenciación neural, por ejemplo, la diferenciación astrocítica de células de glioma C6 se induce mediante la administración de dbcAMP (cAMP de dibutirilo) (Messens y Slegers 1992; Hu et al., 2008)

<span style="font-family: Arial,Helvetica,sans-serif;">6-Descubrimientos científicos más importantes obtenidos con esta línea celular
<span style="font-family: Arial,Helvetica,sans-serif;">Uno de los descubrimientos que se han llevado a cabo en esta línea celular es la importancia del micro-RNA30c en la autorenovación y la diferenciación de las células de glioma de esta línea (C6). Este descubrimiento se ce reflejado en el artículo "The role of microRNA-30c in the self-renewal and differentiation of C6 glioma cells" (Chuan et al., 2015).

<span style="font-family: Arial,Helvetica,sans-serif;">Otro estudio destacable fue el de "Invading C6 glioma cells maintaining tumorigenicity" de (Chicoine et al., 1995), en él principalmente se usó para caracterizar la invasión de las células de glioma de rata, implantaron células marcadas con un fluoroforo en el lóbulo frontal de rata. Se experimentó con la línea celular C6 (que fueron marcadas con ADN p3’) y tras la implantación se confirmó que las células cultivadas del hemisferio contralateral y se derivaron de las células C6 que se habían implantado previamente. Además en este estudio tras la experimentación con células C6 ancladas en agar, fueron utilizadas para verificar que el movimiento (tumor me imagino) al hemisferio contralateral es secundario con respecto a la invasión parenquimatosa en lugar de la dispersión en el líquido cefaloraquídeo.

Para la conservación de la línea celular se utiliza una mezcla crioprotectora que consiste en 10% DMSO y 90% SFB, el DMSO actúa como agente criopreservante ya que es permeable a través de la membrana y puede desplazar parte del agua del interior de la célula evitando así la formación de cristales de hielo intercelulares los cuales pueden dañar las estructuras de la misma, provocando incluso su destrucción. El enfriamiento se lleva a cabo en cámara que utiliza isopropanol y permite realizar un enfriamiento progresivo de 1ºC por minuto (Nalgene), para que la formación de los cristales intracelulares sea lo menos dañina posible.

Las células en fase de crecimiento exponencial son tripsinadas, contadas y centrifugadas a 200 g durante 5 minutos. Se descarta el sobrenadante y el pellet celular se resuspende en el volumen necesario de mezcla crioprotectora para obtener una concentración entre 2 y 3x106 cel/mL. Se dispensará entre 1-1,5 mL de la suspensión celular por criotubo, los cuales deben ser almacenados en la cámara de congelación en un freezer de -80 oC.

Para el descongelado y revitalización se coloca un criotubo en un baño de agua a 37 °C. Las células descongeladas se transfirieren a un tubo cónico con 10 mL de medio de cultivo a 37 °C y se centrifuga a 200 g durante 5 minutos. Se descarta el sobrenadante, el pellet celular se resuspende en 1 mL de medio de cultivo y se realiza el recuento celular con el objeto de evaluar cantidad y viabilidad de las células recuperadas. Finalmente, las células están listas para sembrarlas en los flask.

https://www.colibri.udelar.edu.uy/jspui/bitstream/123456789/5115/1/uy24-17355.pdf

<span style="font-family: Arial,Helvetica,sans-serif;">8-Bibliografía
<span style="font-family: Arial,Helvetica,sans-serif;">(ATCC, 1992.; Benda, 1968; Gysin, 1980; Pfeiffer, 1970)