MRC-5

= =

= =

 MRC-5 con microscopio confocal

1. Introducción

La línea MRC-5, cuyas siglas significan "Medical Research Council 5", son células que provienen de fibroblastos de pulmón humano de un feto masculino de 14 semanas. Esta línea celular fue preparada y desarrollada por J. P. Jacobs en 1966 (15) y fue capaz de de crecer continuamente durante más de de 40 pases manteniendo el cariotipo diploide normal (17, 20).

MRC-5 es sensible a la infección de una gran variedad de virus como pueden ser la polio, el virus del herpes simple, la rubeola, el sarampión, la hepatitis A y el enterovirus 71. (20) Es por esto que se trata de una línea celular usada mayormente para la replicación y elaboración de vacunas virales. (2)

2. Breve recuerdo histórico



Esta línea procedente de fibroblastos pulmonares y cariotipo 46XY, se obtuvo en septiembre de 1966 en Londres a partir de células de pulmón de un feto varón abortado por problemas psiquiátricos de la madre, la cual tenía 27 años, un historial genético normal, y sin indicios de enfermedad neoplásica tanto en el momento del aborto como al menos tres años después. No había indicios de anomalías congénitas. Por otro lado, se han comparado estas células con las WI-38 con la posibilidad de ser sus sustitutas. (3)

3. Caracterización de la línea

Los fibroblastos son las células más ubicuas del organismo y las principales células del tejido estromal y juegan un papel muy importante en la reparación de los tejidos dañados. La línea celular derivada de estas células tienen la morfología, el crecimiento y la expresión génica característica de las células troncales embrionarias y las células de origen neuro-ectodérmico. Se ha visto que cuando estas células están en estado proliferativo expresan factores de transcripción de células pluripotentes como son OCT-3/4 y REX-1 y antígenos de superficie de células embrionarias como SSEA-1, SSEA-3 y SSEA-4 como también TRA-1-60 y TRA-1-81. Por otro lado, expresan genes neuroectodérmicos. todos estos datos indican que las células conocidas comúnmente como fibroblastos tienen características de células totipotentes y pueden ser inducidas para llegar a ser células neuroectodérmicas e incluso neuronas maduras. (14)

La línea MRC-5 se utiliza comúnmente en vacunas como huésped de transfección y para la prueba in vitro de citotoxicidad. Puede doblar su población de 42 a 46 veces antes de entrar en senescencia. Se trata de líneas celulares susceptibles a poliovirus 1, herpes simple y estomatitis vesicular (cepa de Indiana). Sin embargo, la línea es negativa para la transcriptasa inversa, lo que indica la falta de genomas de retrovirus integrales. (7)

Las células MRC-5 crecen de forma adherente en cultivo. La línea MRC5 se replica más rápidamente que las Wi-38 (mientras que las MRC5 crecen en 3 días, las Wi-38 lo hacen en 4 días). (8)

Los fibroblastos no transformados, incluidos los fibroblastos humanos, son capaces de realizar un número limitado de divisiones celulares en cultivo. Para las células MRC-5, se logró un número total de aproximadamente 60 DP, aunque en algunos experimentos solo se consiguieron 42 DP (16)



= = 4. Requerimientos para su mantenimiento


 * __Medio de cultivo de MRC-5__: El medio de cultivo recomendado para estas células es DMEM (medio Eagle modificado de Dulbecco) con alto contenido en glucosa, con NEAA (non essential aminoacids), sin glutamina y suplementado con penicilina y estreptomicina para evitar contaminaciones bacterianas. Se suplementa también con L- glutamina y un 10% de suero fetal bovino (6).


 * __Condiciones de cultivo:__ En cuanto a las condiciones de cultivo, la temperatura óptima es de 37ºC, una humedad relativa del 90%, así como un 5% de CO 2 (6).


 * __Protocolo de subcultivo:__ Para este protocolo, los volúmenes empleados son para un matraz de 75 centímetros cuadrados (volúmenes que pueden aumentarse o reducirse en función de lo que se necesite):


 * 1) Elimina y descarta el medio de cultivo.
 * 2) Enjuague brevemente la capa de células con 0,25% (p / v) de solución de tripsina-EDTA 0,53 mM para eliminar todas las trazas de suero que contiene inhibidor de tripsina.
 * 3) Agregue entre 2,0 y 3,0 ml de solución de Tripsina-EDTA al matraz y observe las células bajo un microscopio invertido hasta que la capa de células se disperse (por lo general suele tardar de 5 a 15 minutos). Para evitar aglomeraciones, no agite las célulasgolpeando o sacudiendo el matraz mientras espera que se desprendan; en su lugar, si las células son difíciles de desprender, se pueden colocar a 37 ° C para facilitar la dispersión.
 * 4) Agregue de 6.0 a 8.0 mL de medio de crecimiento completo y aspire las células pipeteando suavemente.
 * 5) Agregue alícuotas apropiadas de la suspensión celular a nuevos recipientes de cultivo.
 * 6) Finalmente, incube los cultivos a 37 ° C. (18)


 * __Renovación del medio de cultivo:__ El medio de cultivo debe ser cambiado al menos una vez a la semana (19)


 * __Criopreservación:__ La cripreservación ha de ser realizada en un medio de crecimiento completo 95%, y con DMSO 5-10%. Una vez realizada la criopreservación, las muestras han de ser almacenadas a la temperatura del vapor de nitrógeno líquido (18).

= = 5. Principales usos en investigación o clínica con justificación de sus ventajas frente a otros tipos celulares

La línea MRC-5 ha tenido múltiples usos a lo largo de la historia: Esta linea se está utilizando para la manufacturación de preparaciones inmunológicas, además de para la síntesis de vacunas a escala industrial. (4) Las vacunas de células diploides humanas (WI-38, MRC-5) tienen un origen éticamente objetable, dado que dichas células proceden de abortos provocados. Entre ellas destacan vacunas empleadas contra rubéola, sarampión, parotiditis, rabia, poliomielitis, viruela, hepatitis A, varicela y herpes zóster. También con igual origen se trabaja en la elaboración de anticuerpos monoclonales y otras proteínas, terapia génica y genómica. (3)

Otras de sus aplicaciones son la transfección de huéspedes y pruebas de la eficiencia de transfección de host de virus (17)

El uso de cultivos celulares de MRC5 como sustrato para el aislamiento y la producción de biológicos destinados a la salud humana y animal (21)

Si hablamos de las ventajas frente a otros tipos celulares con el suministro cada vez menor de la cepa celular de pulmón fetal humano WI-38, se necesitó un reemplazo para el aislamiento viral. Dos candidatos son las cepas de pulmón fetal humano MRC-5 e IMR-90. Tras realizar comparaciones para evaluar la eficacia y la velocidad del aislamiento, la claridad del efecto citopático y la facilidad de crecimiento de las celulas se vio que la vida más larga de las células MRC-5 las hace más adecuadas que las células IMR-90 para reemplazar la cepa WI-38 para uso de rutina en el diagnóstico viral. (22)

Por otra parte, al comparar esta línea celular con la línea de células de amígdalas fetales humanas, para el aislamiento de rinovirus, observamos que el 74% fueron positivos en MRC-5 con respecto a un 97% en las células de amigdala fetales. Sin embargo, observamos que el tiempo medio para el desarrollo del efecto citopatico fue más corto para estas células. (23). Además, se han realizado estudios que afirman que los co-cultivos de estas células con otro tipo celular aumentan el rendimiento para el aislamiento de virus en cultivo. (23, 24)



6. Descubrimientos científicos más importantes obtenidos con esta línea celular

La cepa celular MRC-5 ha sido muy útil para crear las siguientes vacunas: (1) La OMS dio el visto bueno para trabajar con esta línea y fabricar las vacunas a escala industrial. (4)
 * Vacunas contra la hepatitis A
 * Vacuna contra la rubéola
 * Vacuna contra la varicela
 * Vacuna contra el herpes (zóster)
 * Vacuna oral contra el adenovirus tipo 4 y tipo 7
 * Vacuna contra la rabia

Se ha encontrado un gran número de investigaciones que trabajan con esta línea:


 * En un estudio se utilizó MRC-5 para analizar el comportamiento de la dendroflorina sobre las células. Lo que se ha visto es que beneficia la proliferación celular, desencadena que las células en la fase G1 entren en la fase S. Los resultados indicaron que la dendroflorina es un candidato para la anti senescencia. (5)


 * Se hicieron ensayos de exposición de las células MRC-5 a nanoparticulas de oro. La exposición a nanoparticulas de oro (AuNPs) es una fuente potencial de estrés oxidativo en fibroblastos de pulmón humano y la autofagia puede ser un mecanismo de defensa celular contra la toxicidad por estrés oxidativo. (12)


 * Se han usado células de pulmón fetales, MRC - 5, para demostrar que la carnosina a altas concentraciones (20-50 mM) en medio estándar retarda la senescencia y rejuvenece los cultivos senescentes. La transferencia de nuevo de estas células de paso tardío en medio que contiene carnosina al medio normal no suplementado da como resultado la aparición del fenotipo senescente (13)


 * Por otro lado, ha sido de gran utilidad para el estudio del virus del Herpes Simplex (HSV). En este estudio se comparó la detección de HSV de varios tejidos con la línea celular MRC-5. El virus del Herpes Simplex causa varias manifestaciones clínicas en los hospedadores tanto para inmunocomprometidos como normales. la recuperación del virus en el cultivo de células es considerado como el estándar de oro para la detección de este virus. LightCycler es un sistema diseñado comercialmente para realizar la PCR a tiempo real (qPCR) y detectar los productos con resonancia fluorescente. (9)


 * Esta línea, además, fue de gran utilidad para comparar la utilidad de viales de concha y tubos convencionales sembrados con rabdomiosarcoma y células MRC-5 para la detección rápida del virus del herpes simple, llegando a la conclusión de que es mejor la inoculación con MRC-5 para asegurar una máxima detección del virus. (10)


 * Otra investigación en la que se usó esta línea fue para observar la reducción de varios tipos de virus como el del herpoes simple tipo 1 (HSV-1), virus del herpes simple tipo 2 (HSV-2) y virus varicela-zoster, comparando el uso de aciclovir y la actividad de 9- (4-hidroxi-3-hidroximetilbut-1-il) guanina (BRL 39123). Resumiendo, se obtuvo mejores resultados con BRL 39123 y como dato ninguno de los compuestos afectó significativamente la replicación de células MRC-5. (11) Del mismo modo en otro tipo de estudio se utilizó esta línea. (25)

=Bibliografía=

1. Cepas de células humanas para la creación de vacunas | La Historia de las Vacunas [Internet]. Historyofvaccines.org. 2018 [cited 30 April 2018]. Available from: https://www.historyofvaccines.org/es/contenido/articulos/cepas-de-c%C3%A9lulas-humanas-para-la-creaci%C3%B3n-de-vacunas

2. Jaime C. J, Mancipe L, Ramírez G, Vera V. Cultivos Celulares como Alternativa para el Aislamiento y la Producción de Biológicos Contra el Virus de Influenza. Nova. 2011;9(15):83.

3. Earnshaw DL, Bacon TH, Darlison SJ, Edmonds K, Perkins RM, Hodge RAV. Mode of antiviral action of penciclovir in MRC-5 cells infected with herpes simplex virus type 1 (HSV-1), HSV-2, and varicella-zoster virus. Antimicrob Agents Chemother 1992;36(12):2747-2757.

4. IuKh G. [Use of continuous human and animal cell lines for the production of viral vaccines]. - PubMed - NCBI [Internet]. Ncbi.nlm.nih.gov. 2018 [cited 30 April 2018]. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18368760

5. Jin J, Liang Y, Xie H, Zhang X, Yao X, Wang Z. Dendroflorin retards the senescence of MRC-5 cells. Pharmazie 2008;63(4):321-323.

6. Cilião H, Ribeiro D, Camargo-Godoy R, Specian A, Serpeloni J, Cólus I. Cytotoxic and genotoxic effects of high concentrations of the immunosuppressive drugs cyclosporine and tacrolimus in MRC-5 cells. Experimental and Toxicologic Pathology. 2015;67(2):179-187.

7. Micro.magnet.fsu.edu. (2018). Molecular Expressions Microscopy Primer: Specialized Microscopy Techniques - Fluorescence Digital Image Gallery Human Fetal Lung Fibroblast Cells (MRC-5). [online] Available at: https://micro.magnet.fsu.edu/primer/techniques/fluorescence/gallery/cells/mrc5/mrc5cells.html [Accessed 8 Feb. 2018].

8. JACOBS, J., JONES, C. and BAILLE, J. (1970). Characteristics of a Human Diploid Cell Designated MRC-5. Nature, 227(5254), pp.168-170.

9. Espy MJ, Uhl JR, Mitchell PS, Thorvilson JN, Svien KA, Wold AD, et al. Diagnosis of herpes simplex virus infections in the clinical laboratory by LightCycler PCR. J Clin Microbiol 2000;38(2):795-799.

10. Espy MJ, Wold AD, Jespersen DJ, Jones MF, Smith TF. Comparison of shell vials and conventional tubes seeded with rhabdomyosarcoma and MRC-5 cells for the rapid detection of herpes simplex virus. J Clin Microbiol 1991;29(12):2701-2703.

11. Boyd MR, Bacon TH, Sutton D, Cole M. Antiherpesvirus activity of 9-(4-hydroxy-3-hydroxymethylbut-1-yl)guanine (BRL 39123) in cell culture. Antimicrob Agents Chemother 1987;31(8):1238-1242.

12. Li JJ, Hartono D, Ong C-, Bay B-, Yung LYL. Autophagy and oxidative stress associated with gold nanoparticles. Biomaterials 2010;31(23):5996-6003

13. McFarland GA, Holliday R. Retardation of the senescence of cultured human diploid fibroblasts by carnosine. Exp Cell Res 1994;212(2):167-175.

14. Rieske P, Krynska B, Azizi SA. Human fibroblast-derived cell lines have characteristics of embryonic stem cells and cells of neuro-ectodermal origin. Differentiation 2005 December 2005;73(9):474-483.

15. Jacobs J. The status of human diploid cell strain MRC-5 as an approved substrate for the production of viral vaccines. Journal of Biological Standardization. 1976;4(2):97-99.

16. Sitte N, Merker K, von Zglinicki T, Grune T. Protein oxidation and degradation during proliferative senescence of human MRC-5 fibroblasts. Free Radical Biology and Medicine 2000 March 2000;28(5):701-708.

17. MRC-5 Cell Avalanche™ Transfection Reagent,Will be provided with the purchase of the reagent., [Internet]. Ezbiosystems.com. 2018 [cited 30 April 2018]. Available from: http://ezbiosystems.com/view2.asp?d_id=207

18. MRC-5 ATCC ® CCL-171™ Homo sapiens lung Normal [Internet]. Lgcstandards-atcc.org. 2018 [cited 28 April 2018]. Available from: https://www.lgcstandards-atcc.org/Products/All/CCL-171.aspx?geo_country=es#culturemethod

19. Sitte N, Merker K, Grune T. Proteasome-dependent degradation of oxidized proteins in MRC-5 fibroblasts. FEBS Letters. 1998;440(3):399-402.

20. Zhang K, Na T, Wang L, Gao Q, Yin W, Wang J et al. Human diploid MRC-5 cells exhibit several critical properties of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells. Vaccine. 2014;32(50):6820-6827.

21. Jaime C., J., Mancipe, L., Ramírez, G. and Vera, V. (2011). Cultivos Celulares como Alternativa para el Aislamiento y la Producción de Biológicos Contra el Virus de Influenza. Nova, 9(15), p.83.

22. Friedman HM, Koropchak C. Comparison of WI-38, MRC-5, and IMR-90 cell strains for isolation of viruses from clinical specimens. Journal of Clinical Microbiology. 1978;7(4):368-371.

23. Geist, F. and Hayden, F. (1985). Comparative susceptibilities of strain MRC-5 human embryonic lung fibroblast cells and the Cooney strain of human fetal tonsil cells for isolation of rhinoviruses from clinical specimens. J Clin Microbiol., 22(3).

24. Huang, Y., Hite, S., Duane, V. and Yan, H. (2002). CV-1 and MRC-5 mixed cells for simultaneous detection of herpes simplex viruses and varicella zoster virus in skin lesions. Journal of Clinical Virology, 24(1-2), pp.37-43.


 * **IMÁGENES**
 * 1) Human Fetal Lung Fibroblast Cells (MRC-5 Line) | Olympus Life Science [Internet]. Olympus-lifescience.com. 2018 [cited 30 April 2018]. Available from: https://www.olympus-lifescience.com/en/microscope-resource/galleries/confocal/cells/mrc5/mrc5sb0/
 * 2) JACOBS, J., JONES, C. and BAILLE, J. (1970). Characteristics of a Human Diploid Cell Designated MRC-5. Nature, 227(5254), pp.168-170.
 * 3) JACOBS, J., JONES, C. and BAILLE, J. (1970). Characteristics of a Human Diploid Cell Designated MRC-5. Nature, 227(5254), pp.168-170.
 * 4) MRC-5 ATCC ® CCL-171™ Homo sapiens lung Normal [Internet]. Atcc.org. 2018 [cited 30 April 2018]. Available from: https://www.atcc.org/products/all/CCL-171.aspx#characteristics
 * 5) Molecular Expressions Microscopy Primer: Specialized Microscopy Techniques - Fluorescence Digital Image Gallery - Human Fetus Lung Fibroblast Cells (MRC-5) [Internet]. Micro.magnet.fsu.edu. 2018 [cited 30 April 2018]. Available from: https://micro.magnet.fsu.edu/primer/techniques/fluorescence/gallery/cells/mrc5/mrc5cellslarge1.html