STO


 *  STO ** (Página en construcción) [[image:En-construccion.jpg width="85" height="70"]]

La línea celular STO, son fibroblasto que proceden del tejido embrionario de la especie //Mus musculus//.



=Breve recuerdo historico=

La línea celular STO ( **S **IM  **T** hioguanine/ **O **uabain-resistant) son células de fibroblasto de ratón que se han transformado de forma espontánea a partir de otra línea celular continúa llamada SIM (Sandos Inbred Mice) por Alan Bernstein. Para conocer más la historia de esta línea celular vamos a partir desde el origen.

El ratón es un organismo principal para el estudio de enfermedades humanas. Ha estado en uso desde el Siglo XVI, con investigadores como William Harvey para el estudio de reproducción y la circulación sanguínea como Robert Hooke estudiando la consecuencia biológica por incrementar la presión aérea. Hoy en día se utiliza varias cepas de ratones. En 2011, se estimó un 83% en el uso de una cepa de ratones denominada C57BL/6 en el laboratorio.  Los ratones C 57BL/6 (“B6”) son uno de las cepas más antiguas and más utilizadas para el estudio biomédica y es a partir de estos ratones donde se estableció la línea celular SIM y por consiguiente STO. A partir de unos ratones suizos, albinos, altamente susceptibles al virus Friend, se estableció la línea celular SIM por Ware L. M. and Axelrad A. A. en 1972. Mediante el entrecruzamiento de un gen de resistencia de C57BL/6 fue creada la linea congenica SIM.R. Las celulas STO son fibroblastos transformados derivados de la línea celular SIM. Fueron aislados por primera vez por A. Bernstein en un laboratorio dirigiado a la investigación de cáncer en Ontario, Canada. Fue elegida por su capacidad de resistir la tioguamina y ouabaína, desde ahí su nombre, SIM Tioguanina/Ouabina resistente. Alan Bernstein es actualmente el presidente y director ejecutivo del “Canadian Institute for Advanced Research ” El depositor de esta línea celular es G. Martin en 1975.

=Caracterización de la línea celular=

En cuanto a sus características, es resistente a 6-tioguanina y ouabaína. Son el único tipo celular capaz de generar células embrionarias germinales humanas. Además, en cultivo continuo presentan una gran variedad fenotípica. Son sensitivas al medio HAT (hypoxanthine-aminopterin-thymidine) y HPR negativo . =Medio de cultivo=

Su medio de cultivo estándar contiene DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) junto con 2mM Glutamina y 10% SBF (Suero bovino fetal) a una temperatura de 37ºC y en incubadores con 5% de CO 2.<span style="background-color: transparent; color: #000000; font-family: Arial; font-size: 14.6667px; vertical-align: baseline;">. <span style="background-attachment: initial; background-clip: initial; background-image: initial; background-origin: initial; background-position: initial; background-repeat: initial; background-size: initial; font-family: Arial,sans-serif; font-size: 10pt; line-height: 107%;">El procedimiento para cultivar esta línea a partir de un tubo congelado es el siguiente:
 * 1) <span style="color: #000000; font-family: Arial,sans-serif; font-size: 10pt; line-height: 115%;">Descongelar el vial del ATCC y colocar las células en placas de cultivo Falcon de 10 cm para recubrirlas con 10 mL de medio libre de suero (SFM). Dentro de 2 días, las placas estarán en confluencia, con un rendimiento entre 6-8·106 células.
 * 2) <span style="color: #000000; font-family: Arial,sans-serif;">Aspirar el medio y lavar las células una vez con 5 mL de PBS-CMF
 * 3) <span style="color: #000000; font-family: Arial,sans-serif;">Añadir 3 mL de tripsina con EDTA e incubar la placa a 37ºC durante 5 minutos. Neutralizar la tripsina con 5% de suero de ternera fetal (FCS). Disgregar las células mediante la pipeta para obtener una suspensión de células.
 * 4) <span style="color: #000000; font-family: Arial,sans-serif;">Resuspender las células en 50 mL de medio SFM y dispensar la suspensión celular en 5 placas de 10 cm.
 * 5) <span style="color: #000000; font-family: Arial,sans-serif;">Subcultivar las células cuando éstas lleguen a una concentración de 1.5·106 células/placa. Es importante seguir la pista del número de pasaje.

<span style="color: #000000; font-family: Arial,sans-serif; font-size: 10pt; text-align: justify;">Para prepararlas como //feeder layer// a partir de cultivo se deben realizar los siguientes pasos:


 * 1) <span style="color: black; font-family: Arial,sans-serif; text-indent: -18pt;">Aspirar el medio de las células STO y reemplazar el medio con medio recién preparado por un mínimo de 2 horas.
 * 2) <span style="color: #000000; font-family: Arial,sans-serif; text-indent: -18pt;">Mientras, recubrir la nueva placa de cultivo con 10 mL de una solución de gelatina al 0.1% durante 1 hora a temperatura ambiente.
 * 3) <span style="color: #000000; font-family: Arial,sans-serif; text-indent: -18pt;">Aspirar el medio SFM de las células STO. Lavar las placas 3 veces con 5 mL de PBS-CMF. Tripsinizar con 3 mL de tripsina con EDTA durante 5 minutos y recoger las células en DMEM con 10% de suero de ternera fetal.
 * 4) <span style="color: #000000; font-family: Arial,sans-serif; text-indent: -18pt;">Recoger las células en tubos de centrífuga de 15 mL y centrifugarlos a 183g durante 5 minutos. Resuspender las células con medio de cultivo y realizar un recuento mediante hemocitómetro.
 * 5) <span style="color: #000000; font-family: Arial,sans-serif; text-indent: -18pt;">Dispensar la solución celular sobre las placas recubiertas de gelatina de tal manera que quede una densidad celular de 5·10 <span style="color: #000000; font-family: Arial,sans-serif; font-size: 6.5pt; text-indent: -18pt;">5 <span style="color: #000000; font-family: Arial,sans-serif; text-indent: -18pt;"> células/cm <span style="color: #000000; font-family: Arial,sans-serif; font-size: 6.5pt; text-indent: -18pt;">2 <span style="color: #000000; font-family: Arial,sans-serif; text-indent: -18pt;">. Incubar las placas a 37ºC.
 * 6) <span style="color: #000000; font-family: Arial,sans-serif; text-indent: -18pt;">Las células deberían anclarse al sustrato a los 20 minutos y tras 12 horas, ya formarían una monocapa. Si los cultivos parecen estar muy disperso, una solución es añadir un tratamiento con mitomicina. Estas capas de células se pueden mantener durante 10 días después de la preparación.

<span style="color: #000000; font-family: Arial,sans-serif; font-size: 10pt; text-align: justify;">Para mantener esta línea celular activa durante un tiempo es necesario, como en cualquier otra línea, realizar un subcultivo. En este caso se debe emplear la siguiente metodología:


 * 1) <span style="color: #000000; font-family: Arial,sans-serif; font-size: 10pt; line-height: normal; margin-bottom: 0cm;">Retirar y quitar el medio de cultivo
 * 2) <span style="color: #000000; font-family: Arial,sans-serif; line-height: normal; margin-bottom: 0cm;">Enjuagar brevemente la capa de células con una solución de Tripsina (0.25%)- EDTA (0.53mM) para desechar todos los restos de suero que contiene inhibidores para la tripsina.
 * 3) <span style="color: #000000; font-family: Arial,sans-serif; line-height: normal; margin-bottom: 0cm; text-indent: -18pt;">Añadir 2-3 mL de una solución de Tripsina-EDTA al flask de cultivo y observar las células en un microscopio invertido hasta que las células estén dispersas (normalmente a los 5-15 minutos). <span style="color: #000000; font-family: Arial,sans-serif; line-height: normal; margin-bottom: 0cm;">NOTA: para evitar que las células se agrupen, no hay que golpear o sacudir el flask mientras las células se despegan. Las células que sean más difíciles de despegar pueden ser colocadas en un baño a 37ºC para facilitar el proceso.
 * 4) <span style="color: #000000; font-family: Arial,sans-serif; line-height: normal; margin-bottom: 0cm;">Añadir 6-8 mL de medio completo y aspirar las células con una pipeta.
 * 5) <span style="color: #000000; font-family: Arial,sans-serif; line-height: normal; margin-bottom: 0cm;">Añadir la cantidad de alícuota apropiada de la suspensión celular a los nuevos flask de cultivo.
 * 6) <span style="color: #000000; font-family: Arial,sans-serif;">Incubar a 37º C.

<span style="color: #000000; font-family: Arial,sans-serif; font-size: 10pt;">El radio recomendado para el subcultivo es desde 1:3 hasta 1:10. Además, es necesario renovar el medio de cultivo 2 o 3 veces por semana.

<span style="color: #000000; font-family: Arial,sans-serif; font-size: 10pt;">Para su mantenimiento y transporte de la línea celular se utiliza hielo seco. Evitando los ciclos de congelación y descongelación. El buffer para su almeenamiento es de 5% beta mercaptonetanol. Si se desea llevar a cabo criopreservación el medio usado es completado con un 5% de DMSO y se almacena en vapores de nitrogeno líquido. <span style="background-color: transparent; color: #000000; font-family: Arial; font-size: 14.6667px; vertical-align: baseline;">

<span style="background-color: transparent; color: inherit; font-family: inherit; font-size: 1.4em; vertical-align: baseline;"> **Principales usos en investigación**

<span style="background-color: transparent; color: #000000; font-family: Arial; font-size: 14.6667px; vertical-align: baseline;"><span style="color: #000000; font-family: Arial,sans-serif; font-size: 10pt;">Actualmente esta línea celular es utilizada en muchas investigaciones como //feeder layer// (lámina celular basal), formado por una fina capa celular en la cual se van a cultivar otra línea celular de interés. En estos casos STO permite una mayor fijación y la indiferenciación de estas células. Por todo ello, son nombradas en numerosos artículos como el medio utilizado para cultivar otras células de interés mostrando las ventajas que posee la línea celular STO, tanto en los cultivos de células troncales y en células troncales pluripotentes inducidas (iPSC). El nombre comercial que reciben estas células es SNL 76/7 //<span style="color: #000000; font-family: Arial,sans-serif; font-size: 10pt;">feeder cells, //<span style="color: #000000; font-family: Arial,sans-serif; font-size: 10pt;"> las cuales han sido transformadas con genes que dan resistencia a la neomicina y murina LIF.

<span style="color: #000000; font-family: Arial,sans-serif; font-size: 10pt; text-align: justify;">Al estudios demuestran que estas células tienen capacidad de fagocitar algunos microorganismos gram positivos. Esta propiedad ofrece una gran garantía en su utilización //in vitro//. Este valor añadido da una pequeña ventaja respecto a la contaminación en cultivos primarios, ya que estos son fácilmente contaminables por //Streptococcus.//.

=Descubrimientos destacados=

<span style="background-color: transparent; color: #000000; display: block; font-family: Arial; font-size: 14.6667px; text-align: justify; vertical-align: baseline;"><span style="background-color: transparent; color: #000000; font-family: Arial; font-size: 14.6667px; vertical-align: baseline;">- <span style="color: #000000; font-family: Arial,sans-serif; font-size: 10pt;">Establecimiento y mantenimiento de células troncales embrionarias humanas. (JH Park //et a//l., 2003) Las células troncales embrionarias humanas han sido cultivadas utilizando células STO como //feeder layer//, hasta entonces solo se habían cultivado con fibroblastos primarios embrionarios de ratón. Los resultados fueron positivos, las tres líneas (Miz-hES1, Miz-hES2, and Miz-hES3) se desarrollaron de forma correcta. Por tanto, se comprobó la eficiencia de las células STO como //feeder// para el establecimiento de líneas celulares y, además, contribuyen a mantener su indiferenciación. <span style="color: #000000; font-family: Arial,sans-serif; font-size: 10pt;"><span style="color: #000000; font-family: Arial,sans-serif; font-size: 10pt;">- Regulación del desarrollo de células primordiales germinales en ratones (M. De Felici, 2000). Las células primordiales (PGCs) aparecen en los estadios tempranos del desarrollo embrionario y su función es dar lugar a los gametos. Las células STO se utilizaron para cultivar PGCs con el objetivo de analizar los mecanismos encargados de su desarrollo, supervivencia, proliferación y migración de PGCs.

<span style="color: #000000; font-family: Arial,sans-serif; font-size: 10pt;">-Establecimiento de líneas celulares embrionarias humanas a partir de blastocitos congelados-descongelados usando STO como //feeder layer//. (SP. Park //et// al., 2004). Este estudio indica que el procedimiento seguido miniza los problemas éticos asociados con el uso de embriones humanos en investigación y que el feeder layer de STO puede ser utilizado en células hES.