COS-1

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= Características generales =

Nombre de la línea y tejido de origen
Las líneas COS (COS-1, COS-3 y COS-7) fueron originadas a partir de un cultivo de células CV-1 (fibroblasto) provenientes de epitelio renal de mono verde africano (Cercopithecus aethiops). media type="youtube" key="lJEHaHxYdnA" width="560" height="315" align="center"

Vídeo 1. Definición de las líneas COS.

Historia
La línea celular original de la cual derivaron las líneas COS fue obtenida por Jensen et al. en 1964 a partir de una sección de tejido de epitelio de riñón de un individuo macho adulto (141 días) de mono verde africano. A partir de una transfección de la línea CV-1 con el poliomavirus SV40, en 1981 Gluzman obtuvo las líneas COS, capaces de expresar la fosfoproteína LTag (Large T antigen) del virus SV40, una oncoproteína que principalmente ejerce su acción oncogénica mediante la unión a las proteínas supresoras de tumores p53 y Rb (Retinoblastoma), por lo que el principal uso de estas líneas celulares es en experimentos de transfección de vectores (virales o no virales) que requieran de la expresión de LTag. Entre estas líneas, COS-1 muestra además una inserción e su genoma de la región temprana completa del DNA del virus SV40. El depositante de estas líneas en [|ATCC] es el propio Y. Guzman, quien introdujo en la colección este tipo celular en 1981.

Transformación de la línea
El vector de transfección se creó insertando el genoma del virus en sitio BamHI del vector modificado pMK16#1. El genoma del virus tenia un origen de replicación defectivo en uno de los mutantes a causa de una deleción en dicho genoma de aproximadamente 60 pares de bases en torno a la diana de restricción de BglI. En otros estudios también se han detectado mutantes del virus SV40 con las mismas características, es decir, conservan su incapacidad para replicarse, su capacidad para expresar LTag y para transformar células CV-1 e incluso de rata, pero con deleciones de 4-9 pares de bases. Las células CV-1 fueron obtenidas de ATCC y se hicieron crecer en DMEM + 10% FCS. Se cultivó una monocapa de células y se transfectaron mediante la técnica de precipitación de calcio, un método que convierte a las células animales procedentes de mamíferos en competentes para una efectiva introducción de prácticamente cualquier gen tanto eucariota como procariota. Tras 24 horas, cada cultivo se dividió en 6 subcultivos que se incubaron durante 6 semanas, se detectaron focos de células transformadas que se traspasaron con pipetas pasteur a placas de petri de 2,5 cm. Tras hacer pases durante 1-2 meses se establecieron las líneas **COS-1**, **COS-3** y **COS-7**. = Requerimientos de cultivo, morfología y aplicaciones =

Morfología y propiedades


**Figura 1:** Imagen de fluorescencia de una célula COS-1. Se pueden distinguir el núcleo (azul, DAPI), la red de actina del citoesqueleto (verde, Alexa Fluor 488) y las mitocondrias (rojo, MitoTracker Red CMXRos).

media type="youtube" key="A5uy5cPAS5s" width="630" height="354" align="center" **Vídeo 2:** En el video se observa la membrana de células COS-7 con superresolución (STED). **Figura 2:** En las imágenes podemos observar la morfología de las células COS-7 bajo microscopía de contraste de fases a dos densidades distintas. En imagen de la izquierda podemos ver un cultivo a baja densidad mientras que en la imagen de la derecha se muestra un cultivo a alta densidad.

Condiciones de cultivo
Las células se deben cultivar en DMEM suplementado con 10% de suero fetal bovino (FCS) inactivado por calor, es conveniente además añadir un antibiótico de amplio espectro para prevenir el crecimiento bacteriano, véase 100 U/ml de penicilina o estreptomicina. Las células se incuban a 37ºC con un 10% de CO2. No obstante, también es posible usar DMEM con 5% de FCS y componentes adicionales como 2 mM de L-glutamina o aminoácidos no esenciales, así como añadir 100 U/ml de gentamicina en vez de los antimicrobianos mencionados anteriormente, conservando de esta manera la selectividad frente a bacterias invasoras. En condiciones normales, no se debe dejar que las células alcancen la confluencia o sino formarán sincitos, debemos subcultivar las células para diluir el cultivo. Las células se deben tripsinizar solamente con tripsina al 0,25% o con tripsina + EDTA y se resiembran a una densidad de 2-4·10^4 células/cm^2. Los cultivos semiconfluentes se pueden tripsinizar dejando 1/3 o un 1/6 de las céulas.

Expresión transitoria de proteínas
Debido a que las células COS producen una gran cantidad de copias del antígeno LTag del virus SV40, pese a que no generan partículas víricas cualquier plásmido que contenga el SV40 ori se replica abundantemente (pueden llegar a haber entre 10.000 y 100.000 copias de un plásmido en una célula). Por esta razón es común transfectar estas células con cDNA de una proteína de interés, y es por ello que existen protocolos de transfección estandarizados para llevar a cabo este procedimiento. Uno de ellos es el propuesto por Aruffo en 2002 :
 * 1) Se subclona el gen de interés en el vector adecuado.
 * 2) Se cultivan las células COS-7 en placas Petri de 100mm con medio DMEM-2 CS hasta que alcancen una confluencia del 50%.
 * 3) Justo antes de la transfección se ha de preparar una mezcla con 5mL de DMEM-2 NS (a 37ºC), 0,2mL de solución DEAE-dextrano/cloroquina y 5-10microg del DNA recombinante (vector + cDNA). Una vez preparado se descarta el medio de cultivo anterior y se sustituye por este, dejando incubar las células de 3 a 4 horas a 37ºC (el tiempo puede variar de un caso a otro y podría precisar de ser ajustado).
 * 4) Pasado el tiempo de incubación se descarta el medio nuevamente y añadir 5mL de DMSO al 10% en PBS. Se dejan incubar las células 2 minutos a temperatura ambiente.
 * 5) Se descarta el DMSO y se añaden 10mL de DMEM-2 CS, tras lo cual se dejan incubar las células a 37ºC durante 12-20 horas. Tras este tiempo se deben mirar las células para comprobar como ha transcurrido la transfección, si hay pocas células que se encuentren adheridas a la superficie se debe repetir el experimento. Si la transfección ha concurrido de manera adecuada, es recomendable hacer un pasaje para ayudar a las células a recuperarse del proceso.

Muchas casas comerciales tienen hoy en día kits de transfección eficaces y sencillos que están validados para estas células, un ejemplo es Lipofectamine 3000 (Thermo Fisher Scientific).

Cariotipo
Las líneas de cultivo celular derivadas de células de mono verde africano son un excelente modelo animal empleado en investigación biomédica; sin embargo, el mapeo de su genoma es muy deficiente. De los 31 pares de cromosomas de su genoma, sólo se han mapeado 29 genes (los que mapean también en humanos).



**Figura 3:** Resultado de la hibridación //in situ// de sondas humanas en cromosomas procedentes de mono verde africano.

El bajo número de genes mapeados es el resultado del poco interés en el genoma de la especie más allá de su aplicación biomédica por su similitud con los humanos. Tanto es así que el cariotipo de las líneas celulares **COS** no se encuentra registrado en los catálogos de líneas celulares consultados.

Usos y aplicaciones
Tratándose de líneas celulares no primarias, su principal uso en investigación está enfocado al estudio del comportamiento celular aplicado a la propia fisiología celular o al modelado de enfermedades. Por ejemplo, la línea COS-7 se ha venido utilizando como modelo para la localización subcelular de la proteína pnkd-L, implicada en la patogenia de la disquinesia paroxística no quinesigénica, un trastorno genético asociado al movimiento. También se ha utilizado esta línea celular para dilucidar la localización celular de una proteína cuando esta no puede ser visualizada en la célula de origen. Se inserta en la célula un plásmido con el cDNA de la proteína en cuestión unida a un TAG (un TAG es una molécula, cuya naturaleza puede ser muy diversa, que es fácil de visualizar o detectar en la célula).

Por otro lado, en industria, el uso de estas líneas es de especial relevancia como biofactorías de proteínas recombinantes. Estas células cuentan con numerosas ventajas a la hora de realizar experimentos de expresión heteróloga de proteínas en grandes cantidades y de manera transitoria, véase el gran número de copias de plásmidos con SV40 (en este caso su origen de replicación sí es funcional, lo cual es necesario para que el plásmido se multiplique dentro de la célula) presentes en las células COS 48 horas después de la transfección, la gran disponibilidad de vectores de expresión para esta línea y los eficientes métodos de transfección disponibles. Un ejemplo de esta última aplicación es la expresión de las isoformas de la hialurona sintasa mediante los genes HAS1, HAS2 y HAS3, demostrándose que la expresión de estos tres genes en COS-1 de manera individual es suficientemente alta como para formar una capa extracelular de ácido hialurónico sin necesidad de expresar el receptor para esta molécula o suplementar con proteoglicano.

A diferencia de otras líneas celulares, la peculiar dotación vírica de estas líneas las convierte en un medio ideal para el estudio de los propios virus SV40 de simio. Así pues, uno de sus principales usos es la obtención de partículas víricas intracitoplasmáticas (ICAP). Para ello, se infectan las células con el virus, que se reproduce en ellas, y se obtienen tras el lisado celular. Por otro lado, también se han utilizado para el estudio de otros virus, como el virus de la fiebre porcina africana (Afrian Swine Fever; ASF). Se ha visto que estas células pueden ser eficientemente infectadas por este virus con la ventaja de que son líneas celulares inmortalizadas, a diferencia de sus huéspedes naturales los monocitos y macrófagos porcinos.

También se pueden utilizar para comprobar que un vector de expresión eucariota se expresa correctamente y para la producción de lentivirus en su interior, mostrando además ventajas frente a otras líneas celulares como HEK293T para esta última aplicación debido a su mayor adherencia al sustrato y menor probabilidad de contaminación. En los últimos años se han desarrollado técnicas que permiten la construcción de pseudoviriones del Virus del Papiloma Humano (HPV) con la intención de investigar los primeros estadios de la infección. La importancia de los pseudoviriones radica en que las partículas son partículas puras, sin //helper// virus. = **Referencias** =

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