LLC-PK1

=Características de la línea celular= toc

Nombre de la línea celular, tejido y organismo de origen
La línea celular LLC-PK1 (acrónimo de Lilly Laboratories Cell - Porcine Kidney) proviene de un tejido de epitelio de riñón. Este tejido tiene como organismo de origen el cerdo (//Sus scorfa//).

Historia
Esta línea celular fue descubierta por Hull y Huseby el 9 de septiembre de 1975, cuyo artículo fue publicado en 1976.

El nombre del depositante fue Eli Lilly & Co, una farmacéutica norteamericana creada en 1876 que cuenta con numerosas plantas en muchos países. Es responsable del desarrollo y comercialización del conocido antidepresivo Prozac.

Las células de LLC-PK1 son una patente de dicha farmacéutica. El número por el que es reconocida como patente, en Estados Unidos, es 3,904,480.

Las células de esta línea presentan un nivel de bioseguridad de tipo 1, según las Directrices del Servicio de Salud Pública de los EE.UU.

Proviene del riñón de un cerdo macho joven de la raza Hampshire. Hull y Cherry en su artículo que originó esta línea celular, extrajeron los riñones de este cerdo y tripsinizaron su tejido según el método de Younger. Con esta suspensión se extrajo un inóculo que incubaron durante cuatro días con medio 199 que contiene 10% de suero de caballo (HS) y 100 unidades de penicilina y 100 g de estreptomicina por mL. El primer subcultivo se realizó en el día 6 y a partir de este día, se iban haciendo pases cada semana, hasta llegar a realizar 88 pases para finalmente poder congelarlo en nitrógeno líquido. La vida media de la línea es de tres a cuatro semanas.

Tiene características del epitelio del túbulo proximal, como por ejemplo sistemas de transporte Na+ dependientes. También enzimas situadas en la membrana apical, como la fosfatasa alcalina y la 𝛾-glutamil transpeptidasa, o una resistencia eléctrica de la monocapa de 127 Ω*cm2, similar a la del epitelio permeable. Por consiguiente, las células LLC-PK1 podría ser una herramienta fundamental para examinar las funciones de las células del túbulo proximal.



En las imágenes que se encuentran en la parte superior se puede comprobar cómo se ven las células LLC-PK1 en un cultivo. Fácilmente visible es el hecho de encontrar las células muy unidas entre sí formando una capa, ya que se trata de un epitelio, las uniones intercelulares son muy íntimas. A la izquierda, la fotografía muestra un cultivo con un aumento de 10x un día antes de hacer el subcultivo, es decir, cuando ya se encuentran estas células al final de la fase log. A la derecha y con los mismos aumentos, la microscopía enseña el estado del cultivo un día después de hacer el subcultivo, cuando están empezando a proliferar.

= Caracterización de la línea =

Propiedades morfológicas
La línea celular LLC-PK1, se caracteriza por poseer una superficie monocapa que muestra un característico microvilli y un núcleo microfilamentoso. Observamos su membrana basal con aspecto liso y con mínimas interdigitaciones. El núcleo se sitúa en el centro de la célula, y el resto de los órganos citoplasmáticos se localizan en la mitad basal de las células. El aparato de Golgi, se encuentra en el centro del citoplasma junto al polo basal del núcleo. Sin embargo, el retículo endoplasmático está localizado hacia uno de los laterales.

La microscopía electrónica, además, reveló que las células se asocian en rosetas que recuerdan a los túbulos. Tienen numerosas microvellosidades alargadas y una lámina basal que rodean las membranas celulares. Entre estas membranas hay uniones celulares.

En lo referente al metabolismo, esta línea se caracteriza por acumular alfa-metil-D-glucósido en un gradiente de concentración celular. Este sistema está fuertemente inhibido por florizina y 6-desoxi-D-glucosa. Estudios de Mullin han concluido que cuando hay menos densidad de las células LLC-PK1, no son capaces de acumular alfa-metil-D-glucósido y es menos sensible a la inhibición de los elementos antes citados. Se ha podido observar por microscopía electrónica que los cultivos menos densos carecen de la superficie de microvillis. Por tanto, la densidad celular es un factor en la aparición de algunas propiedades morfológicas.

Por otra parte, las células LLC-PK1 no sintetizan D-glucosa o glucógeno a partir de L-lactato en cultivo. También producen urea no marcada en presencia de L-lactato. No hay evidencia de que esta línea celular tenga una gluconeogénesis neta que resulta de interés porque poseen un sistema de transporte activo de azúcar, y tanto el transporte activo de azúcar como la gluconeogénesis se localizan juntas in vivo en el túbulo proximal.

En referencia a posibles alteraciones genéticas y estudios de mutantes, cabe señalar que estas células expresan establemente la aquoporina 2. Se ha encontrado el mutante 256Ser-Ala-AQP2 que es deficiente en la fosforilación de Ser256. Esta mutación implica que no habrá una inserción en la membrana de las células de LLC-PK1 de AQP2, ni siquiera en presencia de estimulantes como la vasopresina. En el experimento se demuestra que la inserción de la membrana de AQP2 es una vía dependiente de cAMP y de cGMP en las células epiteliales renales.

Otro estudio de células de esta línea transfectadas de forma estable con metalotioneína-alfa i-2 con un gen de fusión, proporciona un modelo para el estudio del nucleótido guanina que tiene funciones en la proteína reguladora del epitelio. Usando el mismo método, el de transfección, pero en este caso, de una cassete que tiene la capacidad de transportar aniones orgánicos, como Mrp3. Se pudo observar que las células LLC-PK1 aumentaron notablemente la captación dependiente de ATP de taurocolato o glicocolato entre otros compuestos.

Se han realizado tres tipos de subcultivos diferentes por triplicado y el inóculo que se utilizó por primera vez fue de 16 oz.

Mantenimiento
El medio base para esta línea celular es Medio 199 que contiene 1,5 g/L a 2,2 g/L de bicarbonato de sodio. Para hacer el medio de crecimiento completo, hay que añadir suero bovino fetal hasta una concentración final del 3%.

El subcultivo se debe realizar de la siguiente manera (protocolo para flask de 75 cm2): en primer lugar se debe de eliminar el medio de cultivo. A continuación se enjuaga la capa celular con una solución de tripsina al 0,25% (p/v) y 0,53 mM de EDTA. Luego, añadir 2-3 mL de solución de tripsina-EDTA al matraz y observar a través del microscopio invertido que la capa de células se desprenden (tarda de 5 a 15 minutos). Para evitar que las células se agreguen, no se debe agitar las celdas golpeando o sacudiendo el matraz mientras se espera a que se desprendan, aquellas que no se desprendan se pueden colocar a 37ºC para facilitarlo. Se añaden de 2-3 mL de medio de crecimiento completo y se aspiran las células pipeteando suavemente. Después, se resuspende el sedimento celular del medio de crecimiento fresco y se agregan alícuotas apropiadas de la suspensión celular a nuevos recipientes de cultivo. En este momento se puede incubar a 37ºC.

Se recomienda una relación de subcultivo de 1:3 a 1:8 con una renovación mediana de dos veces por semana. Para criopreservar esta línea celular se debe de hacer con un 95% de medio y un 5% de DMSO. Las condiciones de cultivo es a una temperatura de 37ºC con una humedad del 95% y en un incubador de CO2 al 5%.

=Usos en investigación o clínica=

Para estudiar la toxicidad que tienen diferentes fármacos nefrotóxicos se utilizaron las células de esta línea celular gracias a su localización en el epitelio del túbulo proximal del riñón. Lo que se estudió fue que la glicoproteína P que se expresa fuertemente en el borde apical del riñón. Administrando fármacos como la ciclosporina A o tacrolimus, se comprobó la relación entre el nivel de expresión de esta proteína renal y la concentración de dichos medicamentos.

La línea celular también se ha usado para medir la secreción renal de un medicamento llamado digoxina, sustrato de la glicoproteína P. Se vió que en células de la zona apical del riñón porcino de la línea LLC-PK1, con transfección con cDNA de MDR1 humano, el transporte de este medicamento de la zona basal a apical era marcadamente mayor y de apical a basal menor que en otras células no transfectantes; es decir, que no expresaban la glicoproteína P.

Utilizando cultivos celulares como: HepG2, LLC-PK1 y un sistema lector de microplacas se puede determinar la generación de especies reactivas de oxígeno y la captación celular del oxígeno, determinando la variación de la fluorescencia de sensores químicos hidrosolubles sensibles al oxígeno. Se evaluaron las alteraciones inducidas por fármacos al metabolismo celular usando un ensayo respirométrico. Las células de ambas líneas se trataron con concentraciones crecientes de PAP (nefrotóxico que causa daño oxidativo agotamiento de glutatión) y CAA (producido in vivo por el citocromo P450 mediado metabolismo del agente alquilante ifosfamida). Las dos líneas celulares muestran respuestas marcadamente diferentes tras una exposición de 6 horas a PAP. Las células HepG2 mostraron solo una reducción mínima en actividad respiratoria, mientras que las células LLC-PK1 muestran una marcada disminución dependiente de la concentración de las células de riñón.

Un estudio sobre el activador de plasminógeno que produce la línea celular LLC-PK1 en la superficie libre usándose un anticuerpo contra dicho activador para poder localizarlo. Se observó con microscopio electrónico y se localizó más intensamente en las uniones intercelulares puesto que se observaron más cantidad de anticuerpos anti-activador. El desprendimiento de membrana y la presencia de ampollas y vesículas en esa zona puede ser la causa del mecanismo de liberación del activador de plasminógeno en la línea celular LLC-PK1.

Esta línea celular también se usa para estudiar los efectos del antibiótico polimixina B, un compuesto que es nefrotóxico que se usa para combatir infecciones por bacterias gram negativas. Puesto que la línea celular proviene de epitelio del túbulo proximal, resulta interesante comprobar los efectos de la polimixina en células de LLC-PK1. Investigaciones apuntan a que un tiempo de exposición largo de las células al antibiótico, provoca una disminución de su viabilidad.

Otros trabajos señalan su utilización para comprobar los efectos que tienen medicamentos como el cisplatino, un alquilante de ADN, en tratamientos quimioterápicos contra sarcomas o tumores en las líneas germinales. Esto lo hicieron observando el papel de las MAPK (proteínas kinasas activadas por mitógeno) en la apoptosis de diferentes líneas celulares, entre ellas se encuentra LLC-PK1, cuando se colocan bajo los efectos del cisplatino.

La línea celular LLC-PK1 también se usó para investigar el papel de la prostaglandina F2 alfa y la prostaglandina E2 en respuesta a amoníaco metabólico en acidosis aguda.

Resultó interesante la demostración de que la hipoxia química y combinándolo con antimicina A, hizo aumentar la actividad de las proteínas tirosin quinasas antes de cualquier evidencia de apoptosis en las células de LLC-PK1. A parte de esto, la hipoxia química incitó un aumento en la producción de ceramida antes de que se provocara daño en el ADN y posterior apoptosis de las células usadas.

En términos generales, es una línea celular muy trabajada en estudios metabólicos y farmacológicos, ya que su morfología y su localización las confieren de características interesantes en investigación.



=Descubrimientos científicos obtenidos con LLC-PK1=

La línea LLC-PK1 se ha utilizado para investigar el papel fisiológico de la proteína de resistencia al cáncer de mama, la cual ofrece a las células tumorales resistencia frente a medicamentos utilizados para la erradicación del cáncer. Para ello se utilizó la línea celular LLC-PK1 y MDCKII para tratar de determinar la dirección de transporte de los antibióticos de interés mediado por Bcrp1 (homólogo murino de BCRP). Gracias a ello se ha podido averiguar que Bcrp1 media el transporte de fármacos y parece reducir la biodisponibilidad del mismo. Por ello, se plantea la estrategia de realizar inhibidores de BCRP para poder llevar a cabo quimioterapia oral efectiva.

La comprensión del funcionamiento del canal de agua de la aquoporina vasopresina-2 (AQP2) en la membrana apical mediante la electroporación de las células LLC-PK1 ha permitido conocer la traslocación que sufre tras la fosforilación de la serina 256 de AQP2 por la proteína quinasa dependiente de AMPc. Como resultado se expone en manifiesto la gran utilidad de LLC-PK1 para conocer que la serina 256 de AQP2 es necesaria para la exocitosis regulatoria.

La línea celular LLC-PK1 también se ha usado para una investigación sobre qué sustratos tiene la glicoproteína P de la corteza suprarrenal humana, y si también esos sustratos son transportados por esa misma proteína. Para ello se utilizó un epitelio altamente polarizado con células LLC-GA5-COL300 que expresan esta proteína en su superficie apical, y se demostró que el cortisol y la aldosterona son sustratos fisiológicos para la glicoproteína, pero que no todos los sustratos que se unen a ella son necesariamente transportados por esa proteína como la progesterona.

Debido al origen renal de las células LLC-PK1 se ha podido evaluar la implicación del oxalato en los cálculos renales, ya que, el oxalato constituye un producto final del metabolismo que se excreta por el riñón. Aunque se ha considerado un proceso benigno, estudios con las células LLC-PK1 se ha demostrado que las altas concentraciones de oxalato son tóxicas induciendo alteraciones morfológicas y pérdida celular. Sin embargo, los niveles de oxalato que indujeron toxicidad, solo fueron un poco más altos de lo que se esperaría que ocurre en la corteza renal, lo cual sugiere que la hiperoxaluria contribuiría al incremento de la lesión renal.

=Referencias=