HUVEC

= = =**HUVEC - Human Umbilical Vein Endotelial Cell**=
 * **PÁGINA EN CONSTRUCCIÓN** ||

La línea celular HUVEC (Human Umbilical Vein Endotelial Cell) está localizada en el endotelio vascular del cordón umbilical y proviene de la especie //Homo sapiens//. El cordón umbilical está formado por dos arterias y una vena, y se trata del componente vascular entre el bebé y su placenta. Las células endoteliales han sido consideradas como el órgano más importante y extenso del cuerpo humano, revistiendo los vasos sanguíneos y encargándose de mantener la homeostasis vascular. Tras los últimos avances en el ámbito de la biología, se ha determinado que las células endoteliales son metabólicamente muy activas. Estas células, sintetizan y secretan activadores e inhibidores que regulan la coagulación de la sangre y el sistema de fibrinólisis. También secretan otros mediadores que tienen su influencia en la adhesión y agregación de las plaquetas. Una vez que estas células se lesionan, pierden el fenotipo maduro de perfil anticoagulante, antiinflamatorio y antiproliferativo y adquieren un fenotipo embriogénico de características procoagulantes, proinflamatorias y mitógenas.Muchos de estos procesos pueden estudiarse “in vitro” utilizando células en cultivo, siendo las HUVEC el tipo celular que más se usa para estos estudios. Además se ha determinado como sitio ideal de extracción de estas células, debido a que esta vena no tiene colaterales, tiene una gran superficie relativa, es fácilmente accesible y se puede obtener tejido vivo rápidamente. [[image:cultivocelularua/HUEVEC.jpg width="352" height="265" align="center" caption="Figura 1. Caracterización de HUVEC por el método de inmunofluorescencia con anticuerpos frente avWF / Factor VIII y CD31 (P-CAM) y por la captación de Dil-Ac-LDL."]]

 **Historia**
 * Índice ||
 * * Historia
 * Caracterización de la línea
 * Requerimientos para el mantenimiento
 * Principales usos en investigación
 * Descubrimientos
 * Referencias
 * Materiales relacionados con las células HUVEC ||

 La línea celular HUVEC fue depositada por primera vez en 1984 por el investigador Hiroyoshi Hoshi. Esta línea celular apareció por primera vez en el artículo "Brain- and liver cell-derived factors are required for growth of human endothelial cells in serum-free culture". En este artículo se explicaba como debía ser cultivada la línea celular HUVEC en un medio libre de suero para estudiar su endocrinología, su crecimiento y su función.

 **Caracterización de la línea**

** Morfología ** Las células forman colonias en medio semisólido y es común observar desechos de tamaño medio a grande y numerosas células flotando en los cultivos de HUVEC. Las células que están flotando son viables y se retienen con una centrifugación suave, consiguiendo así que vuelvan a la población adherida. Si las poblaciones se encuentran dispersas, el cultivo crecerá lentamente e incluso se parará. Además, hay que cambiarle el medio a las células varias veces por semana, siempre manteniendo las células que se encuentran en suspensión en el mismo lado que las adheridas. Las células pueden aparecer de forma granular, dificultando la observación de los bordes.
 * [[image:https://lh6.googleusercontent.com/aHqTPXpiD_0HHusoKrOpNlvVIJsG-ZxR-sS8yeUyJnOKChlJtEBm90dx55SE75B2TKegIvpE5GG6kN0rhhVQTNqUKDvBB3boSyVcg0_6bpInqe4EhtnyCVg_Pj_vRtE0pIvsM4Vl width="508" height="380"]] ||
 * **Figura 3.** HUVEC a dos densidades distintas ||

 **Defectos genéticos ** El 72% de las células poseen una hipoploidía con 45 cromosomas, al poseer sólo un cromosoma 13. Las variaciones presentes en los cultivos clonales de HUVEC, las cuales se suelen deber a los cambios de medio y las condiciones de crecimientos, se observan en los perfiles STR con alelos inestables en D13S137 alelo #9 y #11 y en D7S820 alelo #12. Otros subclones que coexisten en el mismo cultivos presentan los cariotipos 46,XX,-11,-13,i(11p),i(11q) and 46,XX,+11,-13. Para todos los cariotipos, ambos cromosomas X son normales. Además se han llegado a ver casos de cariotipos con hipotetraploidia.  **Requerimientos para el mantenimiento**
 * [[image:cariotipo1.PNG width="432" height="327" align="center"]] || [[image:cariotipo2.PNG width="434" height="328" align="center"]] ||
 * **Figura 4.** Cariotipo de célula HUVEC en la que se observa la pérdida del cromosoma 13. || **Figura 5**. Cariotipo de célula HUVEC que presenta hipotetraploidia. Se puede observar la pérdida de varios cromosomas.  ||

**Aislamiento de células endoteliales**. Antes de empezar, se calienta una botella con tampón de transporte estéril a 37ºC en un baño de agua. Se prepara un área estéril con compresa estéril bajo la campana de flujo laminar. Un cordón umbilical tiene una vena y dos arterias. Por lo general, la vena tiene un diámetro mayor y una pared más flexibles que los de las arterias. La vena umbilical se canula con agujas estériles con punta roma. La vena se perfunde con M199 utilizando una jeringa de 30 ml para lavar la sangre. Todo el medio se evacua antes de que se tapone la aguja con una jeringa de 1 ml. La vena se llena con colagenasa. El aire contenido en la vena es aspirado en la jeringa 30 ml. El cable con jeringas mantenido en cada extremo se coloca en una botella que contiene tampón de transporte y preincuban en el baño de agua. Se incuba la botella por alrededor de 7 min a 37ºC, pero es importante controlar el tiempo de la de incubación con cada lote de colagenasa para evitar acumulación de fibroblastos y perforación espinal. Después de la incubación en el baño de agua, el cable es masajeado y exprimido con cuidado, procurando el desprendimiento de células. La solución de colagenasa que contiene CE(células endoteliales) se añade desde el cable por perfusión con 20 ml de M199. El efluente se recoge en un tubo estéril de 50 ml estéril que contiene 10 ml de medio de cultivo. Las células se centrifugaron 5 min a 1500 rpm. El medio se descartó, y la CE se resuspenden en 5 ml de medio de cultivo fresco. La suspensión celular obtenida ha de incubarse en un matraz enriquecido con 1% de gelatina, 5% de CO2 a 37ºC. El medio de cultivo se cambia cada 24h. Para lavar el cultivo se usa PBS sin calcio ni magnesio, tras esto, se ponen 3 ml de tripsina y se espera 30-60 segundos para que se produzca el desprendimiento de las células. Tras esto, se adicionan 10 ml de medio de cultivo y se traslada a un tubo para centrifugarlo 5 minutos a 1500 rpm. Al sedimento resultante se le quita el sobrenadante y se le añade medio de cultivo fresco que contiene 200 mg/ml ECGS (150.000 células endoteliales/ml). Tras esto, las células se trasladan a placas o flask para su incubación. El medio de cultivo ECGS se cambiará cada dos días durante el experimento. El tiempo de duplicación de la línea celular HUVEC varía entre 17 y 24h en dichas condiciones de cultivo. Para limitar la variabilidad del lote de células endoteliales, después del primer cultivo, generalmente se agrupan en tres diferentes líneas. Las CE se recuperan del tubo y se lavan en medio FSC al 10%. La incubación con tripsina debe ser tan corta como sea posible con la finalidad de no alterar la expresión de la membrana ICAM-1. 2·10^5 células se incubaron con anti-E-selectina, ICAM-1, anticuerpo VCAM-1 o con el control de isotipo (2µg/ml) en 200 µl en un medio con FSC al 5% durante 30 minutos a +4ºC. A continuación, las CE se lavan tres veces con medio FCS al 5% frío, que contenía 0.001% de azida de sodio. La biotina de cabra con anti-IgG de ratón F (ab’) 2 fragmentos (1/200) son añadidos a la suspensión de células durante 30 minutos a +4ºC. Las CE se vuelven a lavar tres veces con FSC frío al 5%, que contiene 0.001% de azida de sodio. La fluoresceína- estreptavidina (1/200) es añadida a la suspensión de células durante 30 minutos a +4ºC. Las CE se vuelven a lavar siguiendo el mismo protocolo que hemos realizado anteriormente con medio FSC. Se realiza el análisis de FACS.
 * Análisis de E-selectina mediante una citometría de flujo, moléculas de adhesión ICAM-1 y VCAM-1.**

Principales usos en investigación
La línea celular HUVEC es comúnmente usada en el estudio de diferentes procesos biológicos, entre los que incluyen los siguientes:
 * Adhesión leucocito-endotelio, el cual es un paso clave para la recirculación linfocitaria y la migración de las células del sistema inmune hacia los tejidos inflamados.
 * Extravasación de los leucocitos a través de los vasos sanguíneos.
 * El proceso de comunicación cruzada entre el endotelio y las células inmunes, dando como resultado la expresión de moléculas de adhesión y citokinas
 * También se ha estudiado con estas células las placas de ateroma, las cuales son dependiente de diferentes eventos metabólicos e inflamatorios.
 * Otro de sus usos es en el estudios de la aparición de metástasis, que está influenciada por la interacción adhesiva entre las células tumorales y las célula endoteliales

= Descubrimientos =

La linea celular HUVEC es usada en una gran cantidad de estudios, pero algunos de los que mas repercusión han tenido y que han proporcionado las descubrimientos más relevantes son los siguientes:
 * Gracias a esta línea celular se descubrió que la IL-8 está directamente implicado en la proliferación de células endoteliales y de la angiogénesis.
 * También varios estudios han proporcionado información de como actúa el óxido nítrico en nuestro organismo. Se descubrió que la formación del NO (óxido nítrico) mediada por estrés interfiere en la transducción de señales de muerte celular y contribuye en la integridad de las células endoteliales inhibiendo la apoptosis.
 * Otro de los descubrimientos más importantes sobre el efecto del NO fue en el cual se descubrió que la exposición de HUVEC a corto y largo plazo con NO genera óxido nítrico biológicamente activo, lo que sugiere que este está implicado en mediar aspectos de señalización de los VEGF (Factores de crecimiento endotelial vascular) implicados en la proliferación de células endoteliales.
 * Además también se pudo es pudo estudiar la inhibición del Factor de Crecimiento Endotelial Vascular (VEGF) la cual produce la proliferación de células endoteliales.

Materiales relacionados con las células HUVEC
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 * Extracción de HUVEC.
 * Cultivo de células HUVEC durante 72h. Time-lapse.
 * Células HUVEC vistas con Cytonote, microscopio de vídeo que trabaja directamente dentro de la incubadora.